图像亮度解析
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无论在光学显微镜利用的成像模式，图像的亮度是由聚光功率的目标，这是一个数值孔径的功能。正如显微镜源照明的亮度是由冷凝器的工作数值孔径的平方来确定，标本图像的亮度是物镜的数值孔径的平方成正比。
然而，显微镜照明系统的情况不同，物镜也起着重要作用，在确定图像的亮度。事实上，图像的亮度是横向放大率的平方成反比：
图像亮度α（NA / M 2）
其中NA为物镜的数值孔径和M是放大倍率。上述方程在给定的比率表示在透的客观聚光功率（注：与外延照明的情况下有所不同，在下面讨论）。表1列出了选定的目标，有不同程度的光学矫正聚光能力的例子。在一般情况下，与高数值孔径的目标也能更好地纠正色差。因此，相同的放大倍率，高数值孔径物镜收集更多的光线，产生一个更加美好的纠正图像（见表1），和整体形象，更好地解决。
这是显而易见的，从表1的数据研究，在其中一个目标是使用透的情况下，图像的亮度下降迅速放大倍率增加了一系列具有相同校正的目标。相比之下，利用一个类似的目标为外延照明系列产生越来越明亮的图像，通过较低的范围（通过40倍，10倍）的放大倍率的增加，但往往在更高的放大倍率减少。也很明显的趋势为目标，以产生Zui高的数值孔径值在EPI的照明更加明亮的图像（而不是透）。
F（反式）和F（EPI），在表1利用该条款是指客观聚光能力，并根据下列公式计算：
F（跨）= 104•NA2/M2
F（EPI）= 104•（NA2 / M 2）
从理论上讲，光照强度取决于冷凝器的数值孔径和光源图像demagnification的平方的平方（实际上，场光阑的图像变得更亮，因为它是小，按平方律）。其结果是，因为它达到目镜（或摄像系统），也成反比物镜，物镜的数值孔径的平方成正比，标本图像的亮度。因此，当研究标本在透射光下，不改变冷凝器的情况下，改变客观影响图像的亮度，数值孔径和放大倍数的变化。
聚光功率选择目标
| Correction | Magnification | Numerical Aperture | F(trans) | F(epi) |
|---|---|---|---|---|
| Plan Achromat | 10x | 0.25 | 6.25 | 0.39 |
| Plan Fluorite | 10x | 0.30 | 9.00 | 0.81 |
| Plan Apo | 10x | 0.45 | 20.2 | 4.10 |
| Plan Achromat | 20x | 0.40 | 4.00 | 0.64 |
| Plan Fluorite | 20x | 0.50 | 6.25 | 1.56 |
| Plan Apo | 20x | 0.75 | 14.0 | 7.90 |
| Plan Achromat | 40x | 0.65 | 2.64 | 1.11 |
| Plan Fluorite | 40x | 0.75 | 3.52 | 1.98 |
| Plan Apo | 40x (oil) | 1.30 | 11.0 | 18.0 |
| Plan Fluorite | 60x | 0.85 | 2.01 | 1.45 |
| Plan Apo | 60x (oil) | 1.40 | 5.4 | 10.6 |
| Plan Apo | 100x (oil) | 1.40 | 1.96 | 3.84 |
| Plan Apo | 100x (oil) | 1.45 | 2.10 | 4.42 |
| Plan Apo | 100x (oil) | 1.65 | 2.72 | 7.41 |
表1
在外延照明的情况下，同样的考虑也适用于，除了客观也作为冷凝器，并考虑图像的亮度时，必须考虑。由于物镜的增加，减少光源图像（demagnified）同等数额，在亮度水平，是较少依赖物镜数值孔径（亮度是由数值孔径的第四权力管辖EPI照明）。在实践中，图像亮度的数字有所不同（见表1）由于客观后方的光圈大小的差异。
当光线水平限制，Zui高的数值孔径目标应雇用，但客观和目镜的放大倍数应在保持所需的分辨率兼容的Zui低水平。在许多情况下，制造商提供更高的数值孔径，以及相应的更高的图像亮度值油浸目标，比同类放大高干燥同行。例如，表1的复消色差40X计划浸泡目标计划的消色差透镜40X干客观的数值孔径的两倍，并产生在透射光下的图像亮度的四倍。这些目标产生一个16倍的差距，落射荧光照明下的图像亮度，高数值孔径的油浸产生明亮的图像版本。图2给出了在低和高数值孔径物镜之间光锥大小的相对差异的比较。需要注意的是更高的数值孔径的目标有一个更大的光锥，更大的内部镜片，能够收集远远比具有较低的数值孔径为目标标本光。
传输通过显微镜的光学元件的光量，作为事件强度的功能，尤其是在荧光显微镜的关键。高解析度的荧光成像在情况需要高放大倍率的图像亮度的损失降到Zui低，Zui高数值孔径物镜，应采用具有Zui大程度的透光。如上所述，整体图像亮度迅速下降的放大倍数增加，因此，荧光显微镜的组成部分，应慎重选择，以Zui大限度地通过光学列车的光量通过。
图像亮度
探索如何在数值孔径和放大倍率的变化会影响由显微镜物镜产生的图像的亮度。
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如上所述，利用荧光显微镜EPI -照明配备的目标，为冷凝器和客观的双重目的。通过激发滤光片和反映在过滤器中的立方体双色镜面中的光传递是第一次通过的目标，形成一个倒锥形的照明需要激发标本。中学附加到标本的荧光基团发出的荧光，然后聚集相同的物镜系统，并通过双色镜和屏障过滤器之前被预计到目镜或成像系统。一个高数值孔径的目标，作为一个冷凝器会增加信号强度（光）的方式就是数值孔径的平方成正比。由于聚光能力的客观数值孔径的平方成正比，图像的亮度会随物镜的数值孔径，根据公式的第四种权力：
图像亮度（荧光）αNA4/M2
请注意，在荧光显微镜下，亮度也物镜放大倍数的平方成反比。因此，相同的放大倍率的目标照明领域和荧光图像，图像亮度大大增加，制造商生产与非常高数值孔径的荧光显微镜设计的目标，这是Zui主要的原因与物镜的数值孔径。
观察标本的目镜进一步放大预计到显微镜中间图像平面的衍射极限的形象，也有助于减少整体观察试样的强度。事实上，图像的亮度是目镜放大倍数的平方成反比，需要使用尽可能低的放大倍数要方便地观察标本的荧光目镜的。因此，可以Zui大限度地利用耦合功率Zui低的目镜（虽然10X目镜是Zui常用的）Zui高数值孔径目标在荧光显微镜下的图像亮度。这些言论，主要适用于大量的标本地区，照明均匀度。在重点突出的光点源（例如，每分钟的荧光球）情况下，粒子图像应衍射极限尺寸，放大倍率独立。
增加试样的信号
在荧光显微镜，图像的亮度是由光照强度的荧光量子产率，和显微镜聚光能力。照明和量子产率较高的，更大的荧光信号，图像越亮的力度越大，成为饱和，直到所有的荧光团。同样，在偏振光，图像的亮度是由试样的光照强度和双折射迟缓。值高达四分之一波长的迟缓，规模较大的retardations生产更大的双折射，从而更强的信号。
在这两种情况下，图像亮度控制信号从标本，这是一个产品的光照强度和试样引入光的变化。图像亮度发光，标本本身发光的情况下，显然是受光的幅度，或标本发出的信号。
这一概念是在图3和图4荧光偏振光标本，分别说明。在图3中给出的是一个对数字图像从夹竹桃叶薄外延照明条件下用荧光照明装备了立体显微镜的部分。当薄截面是一个赋予绿色荧光蛋白（GFP）的过滤器设置有一个带通范围在450和490纳米之间的兴奋，标本展品弱的绿色自体荧光（图3（a）），在某些部分是高度可见标本，但在其他非常薄弱。相比之下，激发产生波长更长的带通滤波器（530-560纳米;图3（b））的标本，鲜艳的红色与一个更强大的信号整个薄片的自体荧光。
矿物薄片偏光光学显微镜观察到类似的情况，如图4所示。试样抛光的几乎完全是由长石斜长岩，火成岩节30微米。当高度取向的双折射薄片与光轴垂直的偏振片，光信号，通过分析仪定位是Zui小化（图4（a））。然而，当光轴在一个45度角面向方面的分析仪和偏光镜（图4（b）），光的Zui高金额是由目镜或图像传感器接收。
在其他模式，如显微镜相衬，微分干涉对比（DIC），，暗场，霍夫曼调制对比度等，照明和图像对比度的力度可以独立变化。然而，从图像信号，即每单位变化在光学参数（例如，在路径长度差异）图像亮度的增量，仍然会是由产品的照度和对比度产生的每单位在光学参数的变化。为了检测在任何光学参数小的变化，显微镜应Zui大限度地从特定的参数的变化所产生的信号。
通过显微镜的光传输
对于一个给定的冷凝器和物镜的数值孔径，放大倍率，和照明灯的亮度，在显微镜产生的图像的亮度变化仍然可以透光的光学元件。透光度取决于几个因素，包括镜片和水泥，光接口的反射损失，和灯外套，扩散屏幕，过滤器，偏光片，及其他辅助的光学元件的透过率吸收。典型的高数值孔径物镜的传输曲线如图1所示。这些值都或多或少地代表任何从一个特定的制造商的目标的类，但即使在这些曲线测定的具体类型，确切的传输值，可以有所不同取决于，例如，抗反射涂层和批次个别镜头使用的玻璃。
一些光学元件的透过率（入射强度的百分比传播力度）可以波长依赖性，即使在可见光范围内，如在图1所示。此外，波长在可见光范围内的外，透镜，棱镜，幻灯片，和试样的安装介质的透过率下降明显。这其实是体现计划的20倍福陆客观传输曲线在图1，这表明在透光率稳步下降，所示，波长为400和700纳米之间增加。系列中的其他目标没有表现出这样的波长依赖性的显着程度。
chao过200光学玻璃配方，目前已开发和正在纳入显微镜镜片，镜，过滤器，和分光镜光学设计师。这些眼镜的属性，如折射率，色散，传输，污染物，自体荧光，化学和热电阻的潜力，和整体的同质性，通常是经过精心挑选，以确保Zui高的光学性能。然而，这些因素往往妥协的其他要求，如高传输，在近紫外线范围或高灭绝的因素，在偏光显微镜。一些新的材料，如fluorocrown玻璃，方法，同时避免其弊端，如有机污染物的存在和晶体的微观结构，从而严重降低荧光，偏光显微镜的性能，大部分的天然萤石的属性。完全复消色差校正，但是，仍然需要减少在近紫外线范围内的传输的天然萤石和眼镜。一个理想的妥协往往是半复消色差透镜或萤石的目标，这是一个真正的的多用途的目标，结合You秀的校正，具有良好的对比度，高数值孔径值，高光谱吞吐量。
即使光水泥厚度平均只有约10微米或以下的，可以有双重或多重镜片之间的水泥吸收光谱特性，可能会导致一个不适合特定的应用程序的目标。在大多数情况下，化学和光学特性的光学眼镜，和一些光学水泥，通常是专有的。
在玻璃 - 空气界面的所有表面反射一些光的传输损耗，因此，即使是没有光的吸收和梁是正常的接口的事件。发病率增加的角度，反射和传输损耗增加的方式，取决于光波的振动方向（垂直或平行于入射面）的方向。每个未涂层的玻璃空气接口可以反映四，五％，光束事件垂直于表面（见图5）。每通道通过未经处理的接口透光率，因此在正常发病率的95％至96％。应用抗反射涂层（通常是一个适当的折射率四分之一波厚干涉膜），在玻璃表面的光反射，可以降低到1％或更少的波长和入射角适度的范围，如在图5所示之间的400和850纳米的波长范围。
已开发多层增透膜，它可以减少空气玻璃界面更广泛的波长范围为0.1％，低过值的反思。大多数的普遍使用的多层干涉涂层有一个稍微偏绿色调，而不是单层涂层的紫红色的色调，使得它们更容易识别。一些防反射涂层，尤其是多层的，行为各向异性对非正常事件的波，并可以大幅降低光学系统偏振相关的灭绝的因素。
为目标的复杂性增加，需要更多的镜片，此展露无遗，必须消除内部反射，产生更高的传输，更好的对比度，并减少耀斑。这些属性是特别重要的事件或反射光的应用。单层增透膜，可以追溯到20世纪40年代以来得到完善，并辅以多层膜，在可见光谱范围内的传输，通过空气玻璃界面增加96％左右（不涂）近99.9％（利用多层膜，如上所述，在图4和图5）所示。图6说明上，1.5和1.8（上部和下部的图纸，分别）折射率的玻璃表面多次反射的影响。在较低的折射率（1.5），与他们的16表面的八大要素，每个反射入射光的约4％，只有52％的吞吐量的结果。相比之下，高折射率玻璃镜片（1.8），16家无涂层表面会通过只有26％的入射光。单层增透膜，增加传输到85％，而多层镀膜增加值约94.6％。这吞吐量和相应的内部散射和噪声减少的增加大大提高了图像的对比度，因为它使明亮的特点光明和黑暗的功能更暗。
涂层材料氟化镁或众多的专有材料，所有这些都有自己的光学性质，可能影响传输的光学系统在给定的光谱区域中。在一般情况下，增透膜的干扰特性频谱有限的，建设性的干扰，在可见光范围内的高传输手段以外的传输频段的谐振频率的破坏性干扰。
大多数现代高数值孔径的目标具有高度的校正光学像差，包含多达15个人的镜片和多达10-12空气玻璃接口的。如果镜片涂层，单独轴向光线的反射损失，这些目标将下降约50％的透光率。随着所有的表面涂层使用单一或多层干涉膜，透光率可提高约86％至90％。
除了这些镜头在目标元素之间可能存在有两个和四个打玻璃 - 空气接口，在现代显微镜的光学列车：
•灯箱和集电极 - 4-6个人镜片
•内部眼镜直通车 - 2-8镜，棱镜和中继镜片
•过滤器 - 2-8个单位在传输或落射荧光
•分光镜 - 1-4观察管的单位和摄像系统
•冷凝器 - 4-8镜头，视光学矫正
•样本 - 0-4包括幻灯片和盖玻片
•目镜 - 4-6视光学矫正和设计
•摄像系统 - 2-6透镜，反射镜和滤芯
在极端的情况下，可以有多达五个十几个光接口时，目标是包含。将低于9％的轴向射线显微镜通过与60个非涂布接口传输，和所有的表面涂少许chao过50％。
高品质的镜头涂料是必不可少的，不仅为提高通过显微镜的光传输，同时也为减少由于多重反射在玻璃表面的耀斑。然而，即使是Zui好的涂料不会chao出一定波长范围内的工作。对于某些波长，甚至可以增加涂层的反射系数（一个半波的干涉膜是一个完美的反射）。这是一个重要的一点，记住保持为数字成像，CCD相机，光电二极管，光电倍增管，或视频传感器，光探测器的灵敏度可以很远的人眼的波长峰值。
通过灯夹克的光传输阻塞，除了在光接口反射损失，可能会降低图像的亮度。随着灯的老化，玻璃或石英外套可能开裂或变暗，因为它devitrifies或成为从灯丝或电极雾化蒸发金属涂层或渗透。值得注意的是，灯外套的透光率可能下降中的紫外线比可见光区域更快。在这种情况下可见的亮度，或亮度光度计测量，可能是一个汞或氙弧灯的紫外线输出的贫困指标。
一个毛玻璃扩散屏幕传输只有10％到15％，在其正常的3％轻装上阵。甚至更少的光传输斜入射角。因此，磨玻璃扩散，应避免必须Zui大化时的照明水平。
过滤器和双色镜落在通带变窄的传输。许多干扰滤波器传输峰值传输的波长只有15至30％的入射能量。然而，一些选定的一半传输带宽窄50埃的多层干涉滤光片可以提供75％或更高的峰值透过率。
使用偏光，微分干涉对比（DIC）的光学偏光过滤器还可以大大减少通过显微镜的光传输。即使在偏光器和分析仪轴平行的位置，在高峰期传输的透光率，偏光过滤器设置，与自然光透过率为20％，只有约8％。相比之下，高品质方解石棱镜，具有防反射涂层的盖板可以传输约50％的事件，每对非偏振光的理论Zui大。
图7中给出的是一个插图配置为传播和反射光照明和观察，在现代光学显微镜内部的镜片。注意玻璃 - 空气界面之间的灯和现场的镜头和一个类似数量的垂直照明显微镜广泛。也有大量的接口，在Windows，棱镜和镜头观察管和目镜，以及物镜转换器和冷凝器的集会。
正如上面所讨论的，多种因素可以限制通过许多现代显微镜的光学元件的光传输。其中一个是争取Zui高分辨率，增强模式下的图像本质上是暗淡的，前面列出的所有因素，尤其是在对比，应仔细检查。应该重申，透光率通过整个显微镜是由所有的光学元件的透过率产品的决心。
照明亮度
在管辖与纠正照明（包括集热器透镜系统）和聚光透镜，照度（照度）的科勒照明的条件下领域配备显微镜是由许多因素，包括固有亮度（平均发光密度）光源和光源的收藏家镜头焦距。此外，数值孔径聚光镜系统，冷凝器光圈光圈光圈大小的设置，和整体照明系统的帮助下透过率控制照度。
根据科勒照明，光线从源上的每个点所产生的均匀照明显微镜的视场光阑产生一个明亮的照度和均匀分布的领域（取决于光源的性质）。因此，视场光阑的开放的大小只影响照明领域的直径，而不是它的亮度。
选择光源的发光密度
| Lamp | Current (Amperes) | Luminous Flux (Lumens) | Mean Luminous Density (cd/mm2) | Arc Size (H × W) (Millimeters) |
|---|---|---|---|---|
| Mercury Arc (100 Watt) | 5 | 2200 | 1700 | 0.25 × 0.25 |
| Xenon Arc (75 Watt) | 5.4 | 850 | 400 | 0.25 × 0.50 |
| Xenon Arc (500 Watt) | 30 | 9000 | 3500 | 0.30 × 0.30 |
| Tungsten-Halogen | 8 | 2800 | 45 | 4.2 × 2.3 |
表2
所提供的收集镜头焦距不能太短，项目源，涵盖了整个冷凝器虹膜光圈，收集电力，或F值的镜头（直径/焦距）开放的形象，不影响照度的字段。提供的发光密度，平均光源和冷凝器的数值孔径的平方，确定该领域的照度与光源的形象充满冷凝器光圈开。收集收集镜头和光源的大小影响的领域照度，只有当源图像不覆盖整个冷凝器光圈。
综上所述，平均光密度（单位面积源的光输出）确定图像的亮度，而不是总的光输出，光通量，光源的面积。从源头上光通量的发光密度和源区的产品，而后者只扮演一个次要作用，在确定的平均发光密度。由于源的发光密度限制的领域照度，图像的亮度不能chao过源的发光密度。换句话说，外地永远不能比源亮，不管是什么巧妙的安排和反射镜，棱镜，透镜，或其他组件的组合，受聘于眼镜直通车。表2列出了几种照明光源，具有比较高的发光密度，在光学显微镜，包括规格，如光通量，圆弧的大小，平均发光密度。
应该指出，许多集中的弧光灯（汞和氙气）提供程度非常高的发光密度，高度非均匀的光分布在圆弧程度。一般情况下，电弧在一分钟内现场相邻的电极之一，即使在圆弧的外形尺寸小（0.3 × 0.3毫米的低），Zui亮。当这样一个弧形的形象进入冷凝器光圈预计，不再有光照强度均匀分布。因此，标本中的每个点所产生的衍射图样，背离理想的艾里斑。然而，这些弧灯是必不可少的，因为高发光密度平均在显微镜的某些应用程序（主要是荧光）。这种情况下的补救办法是聘请没有明显的损失平均照度在显微镜可以添加一个光学纤维（纤维束）光加扰器。图8说明了由于光照强度分布不均匀场照明不统一，在客观情况后焦平面的荧光图像。在图8（a）试样的形象是均匀地照亮，将一个可接受的图像投射到传感器。相反，在图8（b），标本是不正常的光照整个视场，并会导致图像具有强度波动的显着程度。
显微镜台下冷凝器是在确定的质量和提供的标本的照明度的关键因素。浸泡介质和无之间的冷凝器顶部的镜头和客观镜头前，可以聘请一些显微镜冷凝器。更多的时候，更高质量的冷凝器设计为一个特定的浸泡介质，具有特定的折射率和色散。填充介质，可油，甘油，水或空气，冷凝器顶部的镜头元件和较低的表面标本幻灯片之间的空间。
大多数的暗场，和一些相衬，微分干涉相衬（DIC）和偏光镜需要沉浸在冷凝器为了实现高冷凝器的数值孔径。冷凝器设计为获得Zui佳性能和Zui低时使用正确的浸泡介质有一个定义的折射率和色散像差。沉浸摒弃过去的临界角损失，消除了额外的折射，Zui大限度地减少光的反射损失，减少光接口，可以分散或在高发病率的角度反映光的数量。这种散射和反射，成为火炬的来源，也改变偏振光的状态，从而减少了在高数值孔径光学系统偏振消光。总之，冷凝器浸泡影响的领域照度以及图像的质量。为了达到Zui大的性能，设计浸入式冷凝器应与正确的介质浸入。
虽然该领域的照度提高冷凝器的数值孔径的平方，开放冷凝器虹膜隔得远远chao出物镜的数值孔径匹配产生耀斑。此外，部分照明，忽略了客观的光圈明图像上叠加产生的暗场图像，从而降低图像的对比度。
结论
视频传感器或感光胶片平面上暴露在光学显微镜下放大倍数的平方成正比，如上所述。因此，图像亮度随放大倍数的平方。在一般情况下，利用显微镜标本的细节暴露，但在同一时间，在显微镜是一种有效的光收集文书。正如望远镜或双目提高我们的视野，在晚上显微镜聚光能力可以有效地捕捉依稀照亮物体的形象。
根据的标本，必须进行可视化的功能，图像可能会变得更有意义，如果收集更多的光线，而不是提高放大倍率。对于发光和荧光标本的数量，轻水平可能被高度放大的图像变得如此之低，无形的或检测不到的，因此完全没有意义的。在这种情况下，图像可以更容易理解，收集更多的光线通过整合随着时间的推移（如果是静态的标本），或通过降低图像的放大倍率。
对于极低的轻级别的情况下，可以Zui大限度地利用以Zui低的整体放大倍率的Zui高数值孔径目标图像的亮度。
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